تفاوت میان نسخه‌های «پادتن مونوکلونال»

بدون خلاصه ویرایش
(ایجاد یک مقاله نو از طریق ایجادگر)
برچسب: افزودن پیوند بیرونی به جای ویکی‌پیوند (پخ)
برچسب: مقالهٔ نیازمند تمیزکاری (AF)
''' آنتی بادی مونوکلونال'''
<br />
یک معرفی کلی بر نحوه ساخت آنتی بادی مونوکلونال.
یک معرفی کلی بر نحوه ساخت آنتی بادی مونوکلونال.<br />
 
آنتی بادی های مونوکلونال (mAb) آنتی بادی های تک اختصاصی هستند که همه مشابه هم هستند چون از سلولهای ایمنی مشخص که از یک سلول کلون شده اند ایجاد شده، برخلاف آنتی بادی های پلی کلونال که از سلول های ایمنی متفاوتی ایجاد می شوند. آنتی بادی های مونوکلونال اتصال تک ظرفیتی دارند بدین معنی که همه به یک نوع اپیتوپ متصل می شوند.
تقریبا برای همه نوع ماده ای می توان آنتی بادی مونوکلونال ساخت که به آن اتصال یابد؛ آن ها حتی می توانند آن ماده را ردیابی یا تخلیص نمایند. این توانایی به ابزار مهمی در بیوشیمی ،بیولوژی مولکولی و پزشکی تبدیل گشته است. وقتی به عنوان دارو مورد استفاده اند پسوند mab برای دارو مورد استفاده است.<br />
 
'''فهرست مطالب'''
# '''فهرست مطالب'''
 اکتشاف
# تولیداکتشاف
o#  تولید سلول هیبریدوما
# o تولید سلول هیبریدوما
o تخلیص آنتی بادی مونوکلونال
# o عدم تجانستخلیص آنتی بادی مونوکلونال
# o عدم تجانس آنتی بادی
o نوترکیبی
# o نوترکیبی
o آنتی بادی های کیمریک
# o آنتی بادی های مونوکلونال تماماً انسانیکیمریک
# o آنتی بادی های مونوکلونال تماماً انسانی
 کاربرد ها
#  کاربرد ها
o تست های تشخیصی
# o تست های تشخیصی
o درمان دارویی
# o درمان سرطاندارویی
#  درمان سرطان
 بیماری های اتوایمیون
#  بیماری های اتوایمیون
 مثال هایی از آنتی بادی های مونوکلونال دارویی
#  مثال هایی از آنتی بادی های مونوکلونال دارویی
 منابع
#  منابع
'''اکتشاف'''
<br />
ایده «گلوله جادویی» ابتدا توسط پل ارلیش ارائه شد، که این دانشمند در ابتدای قرن بیستم ادعا کرد که اگر ترکیبی ساخته شود که بتواند به طور اختصاصی به ارگانیسم ایجاد کننده بیماری متصل شود، سپس می توان این ماده را سوار بر یک توکسین نموده و به سمت آن ارگانیسم فرستاد. او و الی مچنیکوف به خاطر این کار علمی که درمان موفقیت آمیزی برای سیفلیس در سال 1910 ایجاد نمود ،در سال 1908 موفق به دریافت جايزه نوبل پزشکی شدند.
ایده «گلوله جادویی» ابتدا توسط پل ارلیش ارائه شد، که این دانشمند در ابتدای قرن بیستم ادعا کرد که اگر ترکیبی ساخته شود که بتواند به طور اختصاصی به ارگانیسم ایجاد کننده بیماری متصل شود، سپس می توان این ماده را سوار بر یک توکسین نموده و به سمت آن ارگانیسم فرستاد. او و الی مچنیکوف به خاطر این کار علمی که درمان موفقیت آمیزی برای سیفلیس در سال 1910 ایجاد نمود ،در سال 1908 موفق به دریافت جايزه نوبل پزشکی شدند.<br />
در دهه 1970 ، سرطان مالتيپل میلومای سلول B شناخته شد، و کشف شد که سلول های سرطانی B ، همه از یک نوع آنتی بادی تولید می نمایند(پاراپروتئین). این اکتشاف برای مطالعه ساختار آنتی بادی مورد استفاده قرار گرفت اما هنوز تولید آنتی بادی های اختصاصی برای یک آنتی ژن ممکن نبود.
 
تولید آنتی بادی مونوکلونال که شامل سلول های هیبرید موش-انسان بود در سال 1973 توسط جرالد شوابر بیان شد و بین افرادی که از هیبریدوماهای انسانی استفاده می کردند به طور گسترده مورد بحث واقع شد، اما بحث بر اینکه چه کسی برای بار اول فرضیه را بیان کرده است باقی ماند. یک سند عملی تاریخی روی این موضوع اعتباری را برای شوابر جهت اختراع این تکنیک به همراه داشت که به طور گسترده هم مورد بحث قرار گرفت ولی خیلی زود بیان شد که او تقلب کرده است.این اختراع توسط کاتن و میل اشتاین و سپس کوهلر و میل اشتاین به عرصه عمل گذاشته شد. کوهلر،میل اشتاین و کاج یرن در سال 1984 جایزه نوبل پزشکی و فیزیولوژی را دریافت نمودند. ایده اصلی بر این قرار بود که سلول های سرطانی میلوما که توانایی ترشح آنتی بادی را از دست داده اند، توسط یک تکنیک با سلولهاي سالم B لقاح کرده و در نهایت نیز بتوان سلول هاي لقاح کرده را جدا نمود. این ایده توسط میل اشتاین و کوهلر در تحقيقشان برای یافتن ابزاری جهت یافتن تنوع آنتی بادی ها به عمل در آمد.
در دهه 1970 ، سرطان مالتيپل میلومای سلول B شناخته شد، و کشف شد که سلول های سرطانی B ، همه از یک نوع آنتی بادی تولید می نمایند(پاراپروتئین). این اکتشاف برای مطالعه ساختار آنتی بادی مورد استفاده قرار گرفت اما هنوز تولید آنتی بادی های اختصاصی برای یک آنتی ژن ممکن نبود.<br />
 
تولید آنتی بادی مونوکلونال که شامل سلول های هیبرید موش-انسان بود در سال 1973 توسط جرالد شوابر بیان شد و بین افرادی که از هیبریدوماهای انسانی استفاده می کردند به طور گسترده مورد بحث واقع شد، اما بحث بر اینکه چه کسی برای بار اول فرضیه را بیان کرده است باقی ماند. یک سند عملی تاریخی روی این موضوع اعتباری را برای شوابر جهت اختراع این تکنیک به همراه داشت که به طور گسترده هم مورد بحث قرار گرفت ولی خیلی زود بیان شد که او تقلب کرده است.این اختراع توسط کاتن و میل اشتاین و سپس کوهلر و میل اشتاین به عرصه عمل گذاشته شد. کوهلر،میل اشتاین و کاج یرن در سال 1984 جایزه نوبل پزشکی و فیزیولوژی را دریافت نمودند. ایده اصلی بر این قرار بود که سلول های سرطانی میلوما که توانایی ترشح آنتی بادی را از دست داده اند، توسط یک تکنیک با سلولهاي سالم B لقاح کرده و در نهایت نیز بتوان سلول هاي لقاح کرده را جدا نمود. این ایده توسط میل اشتاین و کوهلر در تحقيقشان برای یافتن ابزاری جهت یافتن تنوع آنتی بادی ها به عمل در آمد. <br />
 
در 1988، گِرگ وینتر و تیم او پیشگام این تکنیک ها برای انسانی نمودن آنتی بادی های مونوکلونال شدند، و واکنش هايي را که آنتی بادی های مونوکلونال ايجاد می نمودند را از بين بردند.
'''تولید'''<br />
 
'''سلول های هیبریدوما'''
'''سلول های هیبریدوما'''<br />
آنتی بادی های مونوکلونال معمولاً از سلول های لقاح شده میلوما با طحال موش که توسط آنتی ژن مورد نظر اميونيزه شده است ، ساخته می شود. به هر حال پیشرفت های اخير سبب استفاده سلول های B خرگوش برای توليد هيبريدومای خرگوش نيز گرديده است. پلی اتیلن گلیکول برای لقاح غشاهای پلاسمايي مجاور به هم استفاده می شده، اما حاصل این روش کم بوده بنابراین یک محیط انتخابی که فقط سلول های لقاح شده بتوانند در آن رشد کنند مورد استفاده قرار می گیرد. این کار امکان پذیر است چون سلول های ميلوما توانايي سنتز هیپوزانتين گوانين فسفوريل ترانسفراز(HGPRT) را که برای سنتز رهاسازی اسیدهای نوکلئيک لازم است، از دست داده اند. غياب اين آنزيم تا زمانی که مسير سنتز پورين de novo از بين نرود برای اين سلول ها مشکلی ايجاد نمی کند. با قرار دادن سلول ها در معرض آمينوپترين (يک آنالوگ فوليک اسيد، که دهيدروفولات ردوکتاز را مهار می کندDHFR) ، آن ها ديگر نمی توانند از مسير de novo استفاده کرده و نسبت به اسيدهای نوکلئيک کاملاً اوکسوتروفيک می شوند که برای زنده ماندن نياز به مکمل غذايي خواهند داشت.
اين محيط انتخابی HAT ناميده می شود زيرا آن حاوی هيپوزانتين، آمينوپترين و تيميدن است. اين محيط برای سلول های هيبريدوما انتخابی است. سلول های ميلومای لقاح نشده به دليل فقدان HGPRT نمی توانند رشد کنند، و بنابراين نمی توانند DNA را همانند سازی نمايند. سلول های لقاح نیافته به دليل چرخه زندگی کوتاه خود نمی توانند به طور نامحدود زندگی کنند. فقط سلول های هيبريد (هيبريدوما) در اين محيط قادر به زندگی هستند چون سلول طحالی همراه آن HGPRT را تامين کرده و سلول ميلوما ويژگی هايي دارد که آن را ناميرا می نمايد(مثل يک سلول سرطاني).
آنتی بادی های مونوکلونال معمولاً از سلول های لقاح شده میلوما با طحال موش که توسط آنتی ژن مورد نظر اميونيزه شده است ، ساخته می شود. به هر حال پیشرفت های اخير سبب استفاده سلول های B خرگوش برای توليد هيبريدومای خرگوش نيز گرديده است. پلی اتیلن گلیکول برای لقاح غشاهای پلاسمايي مجاور به هم استفاده می شده، اما حاصل این روش کم بوده بنابراین یک محیط انتخابی که فقط سلول های لقاح شده بتوانند در آن رشد کنند مورد استفاده قرار می گیرد. این کار امکان پذیر است چون سلول های ميلوما توانايي سنتز هیپوزانتين گوانين فسفوريل ترانسفراز(HGPRT) را که برای سنتز رهاسازی اسیدهای نوکلئيک لازم است، از دست داده اند. غياب اين آنزيم تا زمانی که مسير سنتز پورين de novo از بين نرود برای اين سلول ها مشکلی ايجاد نمی کند. با قرار دادن سلول ها در معرض آمينوپترين (يک آنالوگ فوليک اسيد، که دهيدروفولات ردوکتاز را مهار می کندDHFR) ، آن ها ديگر نمی توانند از مسير de novo استفاده کرده و نسبت به اسيدهای نوکلئيک کاملاً اوکسوتروفيک می شوند که برای زنده ماندن نياز به مکمل غذايي خواهند داشت.<br />
سپس مخلوط سلول ها رقيق شده و کلون ها از سلول های تک والد روی چاهک های ميکروتيتر رشد می کنند. پس از آن آنتی بادی های ترشح شده با کلون های مختلف از جهت تواناييشان برای اتصال به آنتی ژن مورد بررسی قرار می گیرند(توسط روش ELISA يا آنتی ژن ميکروارای یا ايمونو دات بلات). سپس کارآمدترين و پايدارترين کلون برای استفاده مورد استفاده قرار می گيرد.
هيبريدوما می تواند به طور نامحدود در محيط کشت مناسب رشد کند. حال سلول را می توان به موش تزريق نمود(در حفره پريتوئن). آنجا، این سلول ها ترشحی غنی از آنتی بادی به نام آسيت ايجاد می کنند.
اين محيط انتخابی HAT ناميده می شود زيرا آن حاوی هيپوزانتين، آمينوپترين و تيميدن است. اين محيط برای سلول های هيبريدوما انتخابی است. سلول های ميلومای لقاح نشده به دليل فقدان HGPRT نمی توانند رشد کنند، و بنابراين نمی توانند DNA را همانند سازی نمايند. سلول های لقاح نیافته به دليل چرخه زندگی کوتاه خود نمی توانند به طور نامحدود زندگی کنند. فقط سلول های هيبريد (هيبريدوما) در اين محيط قادر به زندگی هستند چون سلول طحالی همراه آن HGPRT را تامين کرده و سلول ميلوما ويژگی هايي دارد که آن را ناميرا می نمايد(مثل يک سلول سرطاني).<br />
محيط کشت بايد در طي انتخاب آزمايشگاهی غنی شود تا هيبريدوما به طور ايده آل رشد کند. این عمل را می توان با استفاده از يک لايه سلول تغذيه کننده فيبروسيت يا محيط مغذی بری کلون(briclone) انجام داد. محيط کشت متعادل شده با ماکروفاژها نيز قابل استفاده است. توليد در محيط کشت معمولاً بر تکنيک آسيت ترجيح داده می شود چون اين روش برای حيوان دردناک است. هنگامی که روش های ديگر در دسترس است روش آسيت غيراخلاقی تلقی می شود.
سپس مخلوط سلول ها رقيق شده و کلون ها از سلول های تک والد روی چاهک های ميکروتيتر رشد می کنند. پس از آن آنتی بادی های ترشح شده با کلون های مختلف از جهت تواناييشان برای اتصال به آنتی ژن مورد بررسی قرار می گیرند(توسط روش ELISA يا آنتی ژن ميکروارای یا ايمونو دات بلات). سپس کارآمدترين و پايدارترين کلون برای استفاده مورد استفاده قرار می گيرد.<br />
 
هيبريدوما می تواند به طور نامحدود در محيط کشت مناسب رشد کند. حال سلول را می توان به موش تزريق نمود(در حفره پريتوئن). آنجا، این سلول ها ترشحی غنی از آنتی بادی به نام آسيت ايجاد می کنند. <br />
 
محيط کشت بايد در طي انتخاب آزمايشگاهی غنی شود تا هيبريدوما به طور ايده آل رشد کند. این عمل را می توان با استفاده از يک لايه سلول تغذيه کننده فيبروسيت يا محيط مغذی بری کلون(briclone) انجام داد. محيط کشت متعادل شده با ماکروفاژها نيز قابل استفاده است. توليد در محيط کشت معمولاً بر تکنيک آسيت ترجيح داده می شود چون اين روش برای حيوان دردناک است. هنگامی که روش های ديگر در دسترس است روش آسيت غيراخلاقی تلقی می شود. <br />
 
'''تخليص آنتی بادی مونوکلونال'''
<br />
بعد از به دست آوردن نمونه از محيط کشت سلولی يا نمونه مايع آسيت، آنتی بادی مطلوب بايد استخراج شود. آلودگی های خوجود در محيط کشت سلولی همان مواد موجود در آن شامل فاکتورهای رشد، هورمون ها و ترانسفرين ها هستند. بر خلاف آن، نمونه های آزمايشگاهی دارای آنتی بادی های ميزبان ، پروتئازها، نوکلئازها،نوکلئيک اسيدها، و ويروس ها می باشند. در هر دو مورد، بقيه ترشحات سلول های هيبريدوما مثل سيتوکاين ها ممکن است وجود داشته باشند. همچنين آلودگی باکتريايي و وجود اندوتوکسين هم محتمل است. با توجه به پيچيدگی محيط کشت مورد نياز در کشت سلول و بنابراين آلودگی های آنها، يک روش بايد نسبت به بقيه ترجيح داده شود(in vivo,in vitro).
بعد از به دست آوردن نمونه از محيط کشت سلولی يا نمونه مايع آسيت، آنتی بادی مطلوب بايد استخراج شود. آلودگی های خوجود در محيط کشت سلولی همان مواد موجود در آن شامل فاکتورهای رشد، هورمون ها و ترانسفرين ها هستند. بر خلاف آن، نمونه های آزمايشگاهی دارای آنتی بادی های ميزبان ، پروتئازها، نوکلئازها،نوکلئيک اسيدها، و ويروس ها می باشند. در هر دو مورد، بقيه ترشحات سلول های هيبريدوما مثل سيتوکاين ها ممکن است وجود داشته باشند. همچنين آلودگی باکتريايي و وجود اندوتوکسين هم محتمل است. با توجه به پيچيدگی محيط کشت مورد نياز در کشت سلول و بنابراين آلودگی های آنها، يک روش بايد نسبت به بقيه ترجيح داده شود(in vivo,in vitro).<br />
نمونه در ابتدا برای تخليص متعادل يا آماده سازی می شود. سلول ها، بقاياي سلولی ، چربی ها و لخته ها در ابتدا بايد حذف شوند، که اصولاً پس از فيلتراسيون با فيلتر0.45 ميکروليتر توسط سانتريفوژ صورت می گيرد. اين ذرات بزرگ می تواند به عنوان پديده ای به نام ترسيب غشا در مراحل بعدی تخليص مطرح شود. به علاوه ، غلظت محصول در نمونه ممکن است کافی نباشد، به خصوص در مواقعی که آنتی بادی مورد نظر توسط سلولی با سطح ترشح پايين توليد شود. در اين مورد نمونه بايد با سانتريفوژ يا دياليز تغليظ شود.
 
اغلب ناخالصی های باردار معمولاً آنيون هايي از جنس نوکلئيک اسيدها و اندوتوکسين ها هستند. معمولاً آن ها را با کروماتوگرافی تعويض يونی جدا می کنند. همچنين کروماتوگرافی تعويض کاتيونی، در pH پايين استفاده شده که آنتی بادی مطلوب در ستون باقی مانده در حالی که آنيون ها عبور می کنند يا آنيون کروماتوگرافی در pH بالا استفاده شده که آنتی بادی مطلوب از ستون رد شده در حالی که آنيون ها به ستون می چسبند. پروتئين های مختلفی همراه آنيون ها با توجه به نقطه ايزوالکتريکشان (pI) جدا می شوند. برای مثال، آلبومين pI برابر با 4.8 دارد که به طور عمده ای کمتر از آنتی بادی مونوکلونال است که دارای pI برابر با 6.1 می باشند. به عبارت ديگر، در يک pH ، ميانگين بار مولکول های آلبومين بيشتر به سمت منفی سوق پيدا می کند. ترانسفرين ، pI برابر با 5.9 دارد بنابراين با اين روش به راحتی نمی تواند جدا گردد. اختلاف pI حداقل بايد 1 باشد تا جداسازی به طور مناسبی انجام شود.
نمونه در ابتدا برای تخليص متعادل يا آماده سازی می شود. سلول ها، بقاياي سلولی ، چربی ها و لخته ها در ابتدا بايد حذف شوند، که اصولاً پس از فيلتراسيون با فيلتر0.45 ميکروليتر توسط سانتريفوژ صورت می گيرد. اين ذرات بزرگ می تواند به عنوان پديده ای به نام ترسيب غشا در مراحل بعدی تخليص مطرح شود. به علاوه ، غلظت محصول در نمونه ممکن است کافی نباشد، به خصوص در مواقعی که آنتی بادی مورد نظر توسط سلولی با سطح ترشح پايين توليد شود. در اين مورد نمونه بايد با سانتريفوژ يا دياليز تغليظ شود. <br />
ترانسفرين را می توان با کروماتوگرافی حذفی با سايز جدا نمود. مزيت اين روش در اين است که آن يکحی از قابل اعتماد ترين روش های کروماتوگرافی است. از آنجايي که کار ما با پروتئين هاست، ويژگی هايي مثل بار و توانايي اتصال ثابت نيستند و با توجه به pH مولکولی که دارای پروتون يا فاقد آن است متفاوت می باشند در حالی که اندازه تقريبا ثابت می ماند. با اين حال ، اين روش معايبی مثل تفکيک پذيری کم، ظرفيت کم و دفعات شست و شوی کم را دارد.
 
کمی سريعتر، روشی يک مرحله ای از جداسازی به نام کروماتوگرافی اتصال پروتئين A/G وجود دارد. آنتی بادی به طور انتخابی به پروتئين A/G متصل شده بنابراين خلوص بالايي (عموماً بالاتر از 80%) می دهد. به هر حال، اين روش ممکن است برای آنتی بادی هايي که به آسانی آسيب می بينند مشکل ساز باشد چون شرايط سختی در آن استفاده می شود. يک pH پايين می تواند با شکستن باند اتصال آنتی بادی را از ستون جدا نمايد. به علاوه تاثير احتمالی بر محصول ، pH پايين می تواند سبب نشت پروتئين A/G از ستون شده و آن را در نمونه شسته شده ظاهر کند. سيستم های شست و شوی بافری ملايم که از غلظت های بالای نمکی استفاده می کنند نيز برای جلوگيری از مواجهه آنتی بادی ها با pH پايين وجود دارند. هزينه ها نيز يک مساله مهم هستند چون رزين پروتئين A/G از رزين های گران قيمت است.
اغلب ناخالصی های باردار معمولاً آنيون هايي از جنس نوکلئيک اسيدها و اندوتوکسين ها هستند. معمولاً آن ها را با کروماتوگرافی تعويض يونی جدا می کنند. همچنين کروماتوگرافی تعويض کاتيونی، در pH پايين استفاده شده که آنتی بادی مطلوب در ستون باقی مانده در حالی که آنيون ها عبور می کنند يا آنيون کروماتوگرافی در pH بالا استفاده شده که آنتی بادی مطلوب از ستون رد شده در حالی که آنيون ها به ستون می چسبند. پروتئين های مختلفی همراه آنيون ها با توجه به نقطه ايزوالکتريکشان (pI) جدا می شوند. برای مثال، آلبومين pI برابر با 4.8 دارد که به طور عمده ای کمتر از آنتی بادی مونوکلونال است که دارای pI برابر با 6.1 می باشند. به عبارت ديگر، در يک pH ، ميانگين بار مولکول های آلبومين بيشتر به سمت منفی سوق پيدا می کند. ترانسفرين ، pI برابر با 5.9 دارد بنابراين با اين روش به راحتی نمی تواند جدا گردد. اختلاف pI حداقل بايد 1 باشد تا جداسازی به طور مناسبی انجام شود.<br />
برای رسيدن به بيشترين خلوص در يک مرحله، تخليص اتصالی را می توان با استفاده از آنتی ژن برای داشتن بيشترين اختصاصيت آنتی بادی به کار برد. در اين روش، آنتی ژنی که برای جمع آوری آنتی بادی استفاده می شود با پيوند کووالانسی به آگارز متصل شده است. اگر آنتی ژن يک پپتيد باشد، آن را معمولاً با يک سيستئين انتهايي سنتز می کنند، که اجازه اتصال به يک پروتئين حامل را می دهد، مثل KLH در حين پيشروی و حمايت برای تخليص. سپس محيط حاوی آنتی بادی با آنتی ژن غيرمتحرک انکوبه شده ، که به صورت کلی يا در هنگام عبور آنتی بادی از ستون انجام می شود، که در آن به طور انتخابی متصل گرديده و در حالی که ناخالصی ها از ستون شسته می شوند می توان آن را حفظ نمود. سپس شست و شو با بافر pH پايين يا بافر پرنمک برای حاصل کردن آنتی بادی تخليص شده مورد استفاده قرار می گيرد.
 
برای انتخاب بيشتر آنتی بادی ها، آن ها را می توان با استفاده از سديم سولفات يا آمونيوم سولفات رسوب داد. آنتی بادی ها در غلظت پايين نمک رسوب می کنند در حالی که اکثر پروتئين ها در غلظت های بالاتر رسوب می نمايند. مقدار مناسب نمک اگر اضافه شود بهترين جداسازی حاصل می شود. ميزان نمک اضافی سپس بايد با روشی مثل دياليز از محلول خارج شود.
ترانسفرين را می توان با کروماتوگرافی حذفی با سايز جدا نمود. مزيت اين روش در اين است که آن يکحی از قابل اعتماد ترين روش های کروماتوگرافی است. از آنجايي که کار ما با پروتئين هاست، ويژگی هايي مثل بار و توانايي اتصال ثابت نيستند و با توجه به pH مولکولی که دارای پروتون يا فاقد آن است متفاوت می باشند در حالی که اندازه تقريبا ثابت می ماند. با اين حال ، اين روش معايبی مثل تفکيک پذيری کم، ظرفيت کم و دفعات شست و شوی کم را دارد.<br />
خلوص نهايي را با استفاده از يک کروماتوگرام می توان آناليز کرد. هرگونه ناخالصی يک قله ايجاد می کند، و حجم زير آن نشان دهنده مقدار آن است. به جای آن می توان الکتروفورز ژل يا الکتروفورز مويينه را به کار برد. ناخالصی ها سبب ايجاد باندهايي با شدت های مختلف می شوند که به مقدار آن مربوط می شود.
'''عدم تجانس آنتی بادی'''
کمی سريعتر، روشی يک مرحله ای از جداسازی به نام کروماتوگرافی اتصال پروتئين A/G وجود دارد. آنتی بادی به طور انتخابی به پروتئين A/G متصل شده بنابراين خلوص بالايي (عموماً بالاتر از 80%) می دهد. به هر حال، اين روش ممکن است برای آنتی بادی هايي که به آسانی آسيب می بينند مشکل ساز باشد چون شرايط سختی در آن استفاده می شود. يک pH پايين می تواند با شکستن باند اتصال آنتی بادی را از ستون جدا نمايد. به علاوه تاثير احتمالی بر محصول ، pH پايين می تواند سبب نشت پروتئين A/G از ستون شده و آن را در نمونه شسته شده ظاهر کند. سيستم های شست و شوی بافری ملايم که از غلظت های بالای نمکی استفاده می کنند نيز برای جلوگيری از مواجهه آنتی بادی ها با pH پايين وجود دارند. هزينه ها نيز يک مساله مهم هستند چون رزين پروتئين A/G از رزين های گران قيمت است.<br />
عدم تجانس آنتی بادی برای مونوکلونال آنتی بادی ها و ساير محصولات نوترکيب رايج است و معمولاً در حين بيان يا توليد نشان داده می شود.
 
اين واريانت ها معمولاً متراکم می شوند(محصولات دآميداسيون، واريانت های گليکوزيلاسيون، زنجيره های جانبی آمينواسيد اکسيد شده، همچنين اضافات آمينو و کربوکسيل انتهايي آمينو اسيد). اين تغييرات ظاهری لحظه ای در ساختار يک مونوکلونال آنتی بادی می تواند اثر عميقی بر پايداری پيش بالينی و بهبودسازی فرآيند داشته باشد همچنين در پتانسيل درمانی محصول، دسترسی زيستی و ايمنی. روش عمومی پذيرفته شده برای فرآيند تخليص آنتی بادی مونوکلونال، شامل گيرانداختن پروتئين محصول مورد نظر با پروتئين A ، شست و شو، اسيديفيکاسيون برای غيرفعال سازی ويروس های بالقوه پستانداران، کروماتوگرافی تعويض کاتيونی و کروماتوگرافی تعويض آنيون می باشد.
برای رسيدن به بيشترين خلوص در يک مرحله، تخليص اتصالی را می توان با استفاده از آنتی ژن برای داشتن بيشترين اختصاصيت آنتی بادی به کار برد. در اين روش، آنتی ژنی که برای جمع آوری آنتی بادی استفاده می شود با پيوند کووالانسی به آگارز متصل شده است. اگر آنتی ژن يک پپتيد باشد، آن را معمولاً با يک سيستئين انتهايي سنتز می کنند، که اجازه اتصال به يک پروتئين حامل را می دهد، مثل KLH در حين پيشروی و حمايت برای تخليص. سپس محيط حاوی آنتی بادی با آنتی ژن غيرمتحرک انکوبه شده ، که به صورت کلی يا در هنگام عبور آنتی بادی از ستون انجام می شود، که در آن به طور انتخابی متصل گرديده و در حالی که ناخالصی ها از ستون شسته می شوند می توان آن را حفظ نمود. سپس شست و شو با بافر pH پايين يا بافر پرنمک برای حاصل کردن آنتی بادی تخليص شده مورد استفاده قرار می گيرد.<br />
کروماتوگرافی جانشين سازی برای تشخيص و تعيين اين واريانت های ناديده در حجم هايي که برای تاييد در سیستم های بعدی پيش بالينی مثل مطالعات فارماکوکينتيک حيوانی مناسب هستند، استفاده می شده است. دانش به دست آمده در حين گسترش فاز پيش بالينی برای فهم کامل کيفيت محصول ضروری است و يک پايه برای مديريت ريسک و انعطاف پذيری تنظيمی افزوده شده ايجاد می کند. ابتکار اخير کيفيت توسط طراحی اتحاديه های غذا و دارو در تلاش است تا هدايتی در جهت توسعه ايحاد کرده و طراحی محصولات و فرآيندهايي که کارايي و پروفايل ايمنی را افزايش می دهد به حداکثر رسانده درحالی که امکان توليد محصول را بالا می برند.
'''نوترکيب'''
برای انتخاب بيشتر آنتی بادی ها، آن ها را می توان با استفاده از سديم سولفات يا آمونيوم سولفات رسوب داد. آنتی بادی ها در غلظت پايين نمک رسوب می کنند در حالی که اکثر پروتئين ها در غلظت های بالاتر رسوب می نمايند. مقدار مناسب نمک اگر اضافه شود بهترين جداسازی حاصل می شود. ميزان نمک اضافی سپس بايد با روشی مثل دياليز از محلول خارج شود.<br />
توليد آنتی بادی های مونوکلونال نوترکيب شامل فن آوری هايي است که به نام کلونينگ جمعی يا نمايش فاژ/مخمر شناخته می شود. مهندسی آنتی بادی نوترکيب شامل استفاده از ويروس ها يا مخمر برای ساختن آنتی بادی ها است به جای استفاده از موش. اين روش ها به کلونينگ سريع قطعات ژن ايمونوگلوبولين برای ايجاد مجموعه هایي از آنتی بادی ها با اختلافات ناچيز آمينواسيدی نسبت به آنتی بادی هایي با اختصاصيت های مطلوب که قابل انتخاب است، بستگی دارد.مجموعه های آنتی بادی فاژ نوعی از مجموعه های آنتی ژن فاژ هستند که توسط جورج پيژنيک اختراع شد. اين تکنيک ها می تواند برای بالابردن اختصاصيتی که آنتی بادی ها آنتی ژن ها ، پايداریشان در شرايط محيطی مختلف، کارايي درمانی، و قابل جست و جو بودن در کاربردهای تشخيصی را تشخيص دهند، استفاده شود. محفظه های تخمير برای توليد اين آنتی بادی ها در مقياس بزرگ استفاده می شود.
'''آنتی بادی های کيمريک'''
خلوص نهايي را با استفاده از يک کروماتوگرام می توان آناليز کرد. هرگونه ناخالصی يک قله ايجاد می کند، و حجم زير آن نشان دهنده مقدار آن است. به جای آن می توان الکتروفورز ژل يا الکتروفورز مويينه را به کار برد. ناخالصی ها سبب ايجاد باندهايي با شدت های مختلف می شوند که به مقدار آن مربوط می شود. <br />
به زودی متوجه شدند که مشکل اساسی برای کاربرد درمانی آنتی بادی های مونوکلونال روش ابتدايي است که آنتی بادی موشی به جای انسانی ايجاد می کند. علی رغم تشابه ساختاری، اختلافات بين اين دو برای ايجاد يک پاسخ ايمونولوژيک بعد از تزريق اين آنتی بادی به بدن انسان کافی بود، که در نهایت سبب حذف سريع آن ها از خون به علت فعاليت سيستم التهابی و توليد آنتی بادی ضد موش انسانی (HAMA) می گرديد.
 
در تلاشی برای رفع اين مانع، روش هايي برای استفاده از DNA نوترکيب از سالهای 1980 به بعد کشف شد. در يکی از اين روش ها، DNA کد کننده بخش اتصالی آنتی بادی مونوکلونال با DNA توليد کننده آنتی بادی در سلول انسانی زنده ادغام شد. بيان اين DNA کيمريک از طريق کشت سلول آنتی بادی هايي نيمه انسانی-موشی ايجاد نمود.برای اين محصول، لغات توضیحی آنتی بادی «کيمريک» و «انسانی» برای نشان دادن ترکيب منابع DNA انسان و موش در فرآيند های نوترکيبی مورد استفاده قرار گرفت.
'''عدم تجانس آنتی بادی'''<br />
'''آنتی بادی کاملاً انسانی'''
 
از زمانی که فهميده شد که می توان آنتی بادی مونوکلونال ايجاد نمود ، دانشمندان برای جلوگيری از برخی اثرات جانبی آنتی بادی های انسانی شده يا کيمريک به دنبال ساخت آنتی بادی کاملاً انسانی رفتند. دو روش موفق در اين زمينه شناخته شد: موش ترانس ژنی و تظاهر فاژ.
عدم تجانس آنتی بادی برای مونوکلونال آنتی بادی ها و ساير محصولات نوترکيب رايج است و معمولاً در حين بيان يا توليد نشان داده می شود.<br />
موش ترانس ژنی تقريباً موفقترين روش برای ايجاد داروهای آنتی بادی مونوکلونال کاملاً انسانی بوده است: که 7 تا از 9 روش کنونی در بازار تجارت از اين روش تبعيت می کند. موش ترانس ژنی توسط تعدادی از سازمان های تجاری به بهره برداری رسيده است:
 
اين واريانت ها معمولاً متراکم می شوند(محصولات دآميداسيون، واريانت های گليکوزيلاسيون، زنجيره های جانبی آمينواسيد اکسيد شده، همچنين اضافات آمينو و کربوکسيل انتهايي آمينو اسيد). اين تغييرات ظاهری لحظه ای در ساختار يک مونوکلونال آنتی بادی می تواند اثر عميقی بر پايداری پيش بالينی و بهبودسازی فرآيند داشته باشد همچنين در پتانسيل درمانی محصول، دسترسی زيستی و ايمنی. روش عمومی پذيرفته شده برای فرآيند تخليص آنتی بادی مونوکلونال، شامل گيرانداختن پروتئين محصول مورد نظر با پروتئين A ، شست و شو، اسيديفيکاسيون برای غيرفعال سازی ويروس های بالقوه پستانداران، کروماتوگرافی تعويض کاتيونی و کروماتوگرافی تعويض آنيون می باشد.<br />
کروماتوگرافی جانشين سازی برای تشخيص و تعيين اين واريانت های ناديده در حجم هايي که برای تاييد در سیستم های بعدی پيش بالينی مثل مطالعات فارماکوکينتيک حيوانی مناسب هستند، استفاده می شده است. دانش به دست آمده در حين گسترش فاز پيش بالينی برای فهم کامل کيفيت محصول ضروری است و يک پايه برای مديريت ريسک و انعطاف پذيری تنظيمی افزوده شده ايجاد می کند. ابتکار اخير کيفيت توسط طراحی اتحاديه های غذا و دارو در تلاش است تا هدايتی در جهت توسعه ايحاد کرده و طراحی محصولات و فرآيندهايي که کارايي و پروفايل ايمنی را افزايش می دهد به حداکثر رسانده درحالی که امکان توليد محصول را بالا می برند.<br />
 
'''نوترکيب'''<br />
 
توليد آنتی بادی های مونوکلونال نوترکيب شامل فن آوری هايي است که به نام کلونينگ جمعی يا نمايش فاژ/مخمر شناخته می شود. مهندسی آنتی بادی نوترکيب شامل استفاده از ويروس ها يا مخمر برای ساختن آنتی بادی ها است به جای استفاده از موش. اين روش ها به کلونينگ سريع قطعات ژن ايمونوگلوبولين برای ايجاد مجموعه هایي از آنتی بادی ها با اختلافات ناچيز آمينواسيدی نسبت به آنتی بادی هایي با اختصاصيت های مطلوب که قابل انتخاب است، بستگی دارد.مجموعه های آنتی بادی فاژ نوعی از مجموعه های آنتی ژن فاژ هستند که توسط جورج پيژنيک اختراع شد. اين تکنيک ها می تواند برای بالابردن اختصاصيتی که آنتی بادی ها آنتی ژن ها ، پايداریشان در شرايط محيطی مختلف، کارايي درمانی، و قابل جست و جو بودن در کاربردهای تشخيصی را تشخيص دهند، استفاده شود. محفظه های تخمير برای توليد اين آنتی بادی ها در مقياس بزرگ استفاده می شود. <br />
 
'''آنتی بادی های کيمريک'''<br />
 
به زودی متوجه شدند که مشکل اساسی برای کاربرد درمانی آنتی بادی های مونوکلونال روش ابتدايي است که آنتی بادی موشی به جای انسانی ايجاد می کند. علی رغم تشابه ساختاری، اختلافات بين اين دو برای ايجاد يک پاسخ ايمونولوژيک بعد از تزريق اين آنتی بادی به بدن انسان کافی بود، که در نهایت سبب حذف سريع آن ها از خون به علت فعاليت سيستم التهابی و توليد آنتی بادی ضد موش انسانی (HAMA) می گرديد. <br />
 
در تلاشی برای رفع اين مانع، روش هايي برای استفاده از DNA نوترکيب از سالهای 1980 به بعد کشف شد. در يکی از اين روش ها، DNA کد کننده بخش اتصالی آنتی بادی مونوکلونال با DNA توليد کننده آنتی بادی در سلول انسانی زنده ادغام شد. بيان اين DNA کيمريک از طريق کشت سلول آنتی بادی هايي نيمه انسانی-موشی ايجاد نمود.برای اين محصول، لغات توضیحی آنتی بادی «کيمريک» و «انسانی» برای نشان دادن ترکيب منابع DNA انسان و موش در فرآيند های نوترکيبی مورد استفاده قرار گرفت.<br />
 
'''آنتی بادی کاملاً انسانی'''<br />
 
از زمانی که فهميده شد که می توان آنتی بادی مونوکلونال ايجاد نمود ، دانشمندان برای جلوگيری از برخی اثرات جانبی آنتی بادی های انسانی شده يا کيمريک به دنبال ساخت آنتی بادی کاملاً انسانی رفتند. دو روش موفق در اين زمينه شناخته شد: موش ترانس ژنی و تظاهر فاژ. <br />
 
موش ترانس ژنی تقريباً موفقترين روش برای ايجاد داروهای آنتی بادی مونوکلونال کاملاً انسانی بوده است: که 7 تا از 9 روش کنونی در بازار تجارت از اين روش تبعيت می کند. موش ترانس ژنی توسط تعدادی از سازمان های تجاری به بهره برداری رسيده است:<br />
 
• Medarex — who marketed their UltiMab platform. Medarex were acquired in July 2009 by Bristol Myers Squibb[18]
• Abgenix — who marketed their Xenomouse technology. Abgenix were acquired in April 2006 by Amgen.[19]
• Kymab - who market their Kymouse technology.[21]
• Open Monoclonal Technology's OmniRat™ and OmniMouse™ platform.[22]
<br />
يکی از موفق ترين سازمان های تجارتی که از تظاهر فاژ استفاده کرده است Cambridge Antibody Technology (CAT) می باشد. دانشمندان CAT نشان دادند که تظاهر فاژ می تواند مورد استفاده باشد، به طوری که دامنه های متغير آنتی بادی می تواند روی آنتی بادی های فاژی رشته ای بيان شود.
يکی از موفق ترين سازمان های تجارتی که از تظاهر فاژ استفاده کرده است Cambridge Antibody Technology (CAT) می باشد. دانشمندان CAT نشان دادند که تظاهر فاژ می تواند مورد استفاده باشد، به طوری که دامنه های متغير آنتی بادی می تواند روی آنتی بادی های فاژی رشته ای بيان شود.<br />
 
سایر انتشارهای حائز اهمیت:
 
• Marks JD, Hoogenboom HR, Bonnert TP, McCafferty J, Griffiths AD, Winter G (December 1991). "By-passing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage". J. Mol. Biol. 222 (3): 581–597. doi:10.1016/0022-2836(91)90498-U. PMID 1748994.
• Carmen S, Jermutus L (July 2002). "Concepts in antibody phage display". Brief Funct Genomic Proteomic 1 (2): 189–203. doi:10.1093/bfgp/1.2.189. PMID 15239904.
'''کاربرد ها'''<br />
 
'''تست های تشخیصی'''
'''تست های تشخیصی'''<br />
هرگاه آنتی بادی مونوکلونالی برای یک ماده مشخص ایجاد شود، می توان به وسيله آنتی بادی ، حضور آن ماده را بررسی کرد. تست های وسترن بلات و ایمونو دات بلات حضور پروتئین را روی یک غشا بررسی می کنند. آن ها در ایمونوهیستوشیمی بسیار مفید هستند. این تست ها آنتی ژن ثابت شده روی قطعات بافتی را تشخیص می دهند و تست ایمونوفلورسانس ماده را در یک قطعه بافتی یخ زده یا سلول زنده تشخصی می دهند.
 
'''درمان دارویی'''
هرگاه آنتی بادی مونوکلونالی برای یک ماده مشخص ایجاد شود، می توان به وسيله آنتی بادی ، حضور آن ماده را بررسی کرد. تست های وسترن بلات و ایمونو دات بلات حضور پروتئین را روی یک غشا بررسی می کنند. آن ها در ایمونوهیستوشیمی بسیار مفید هستند. این تست ها آنتی ژن ثابت شده روی قطعات بافتی را تشخیص می دهند و تست ایمونوفلورسانس ماده را در یک قطعه بافتی یخ زده یا سلول زنده تشخصی می دهند.<br />
'''درمان سرطان'''
یک راه ممکن برای درمان سرطان استفاده از آنتی بادی مونوکلونال است که فقط به آنتی ژن اختصاصی سلول سرطانی متصل شده و یک پاسخ ايمونولوژیک علیه سلول سرطانی ایجاد می کند. این mAb همچنین برای ارسال یک توکسین، راديوايزوتوپ، سيتوکاين يا کونژوگه فعال ديگری قابل استفاده می باشد. علاوه بر این این امکان وجود دارد که آنتی بادی هايي با دو ويژگی تولید کرد که بتواند به وسيله ناحيه Fab به آنتی ژن هدف و یک کونژوگه یا سلول اثرگذار متصل شود. در واقع، هر آنتی بادی سالم می تواند به سلول گيرنده يا ساير پروتئين ها به وسيله ناحيه Fc متصل شود.
'''درمان دارویی'''<br />
'''بيماری اتوايميون'''
 
آنتی بادی مونوکلونال که برای اين بيماری ها استفاده می شود شامل infliximab و adalimumab است که در آرتريت روماتوئيد، بيماری کرون و کوليت اولسراتيو به وسيله تواناييشان در اتصال به و ممانعت از TNF آلفا است. Basiliximab و daclizumab IL-2 را روی سلول های T فعال غيرفعال می کند و درمان سبب ممانعت از رد پيوند کليه خواهد شد.omalizumab Ige انسانی را غيرفعال کرده و در آسم ملايم تا شديد کاربرد دارد.
'''درمان سرطان'''<br />
 
یک راه ممکن برای درمان سرطان استفاده از آنتی بادی مونوکلونال است که فقط به آنتی ژن اختصاصی سلول سرطانی متصل شده و یک پاسخ ايمونولوژیک علیه سلول سرطانی ایجاد می کند. این mAb همچنین برای ارسال یک توکسین، راديوايزوتوپ، سيتوکاين يا کونژوگه فعال ديگری قابل استفاده می باشد. علاوه بر این این امکان وجود دارد که آنتی بادی هايي با دو ويژگی تولید کرد که بتواند به وسيله ناحيه Fab به آنتی ژن هدف و یک کونژوگه یا سلول اثرگذار متصل شود. در واقع، هر آنتی بادی سالم می تواند به سلول گيرنده يا ساير پروتئين ها به وسيله ناحيه Fc متصل شود.<br />
 
'''بيماری اتوايميون'''<br />
 
آنتی بادی مونوکلونال که برای اين بيماری ها استفاده می شود شامل infliximab و adalimumab است که در آرتريت روماتوئيد، بيماری کرون و کوليت اولسراتيو به وسيله تواناييشان در اتصال به و ممانعت از TNF آلفا است. Basiliximab و daclizumab IL-2 را روی سلول های T فعال غيرفعال می کند و درمان سبب ممانعت از رد پيوند کليه خواهد شد.omalizumab Ige انسانی را غيرفعال کرده و در آسم ملايم تا شديد کاربرد دارد.<br />
 
 
 
۳

ویرایش