تفاوت میان نسخه‌های «اندونوکلئازهای محدودکننده»

اصلاح ارقام
(با فرض حسن نیت ویرایش Saeedbiotech (بحث) خنثی‌سازی شد: تبلیغ. (تل))
(اصلاح ارقام)
== آنزیم‌هایآنزیم های محدودکننده نوع III ==
'''اندونوکلئازهای محدودکننده'''، آنزیم‌هایی هستند اغلب از گروه [[هیدرولاز]]ها که به طور اختصاصی، توالی خاصی را شناسایی کرده و آن را برش می‌دهند. در صورتیکه توالی‌هایی مزبور توسط عواملی مثل متیله‌شدن تغییر یافته باشند مورد شناسائی آنزیم قرار نمی‌گیرند. آنزیم‌های محدودکننده بر حسب نوع فعالیت و توالی مورد شناسائی به سه دسته تقسیم می‌شوند. در زیر به معرفی برخی از آنها می‌پردازیم.
یک آنزیم محدودکننده یا آندونوکلئاز محدودکننده اغلب از گروه [[هیدرولاز]]هاست که به طور اختصاصی، توالی خاصی از [[دی ان ای]] را شناسایی کرده و آن را برش می‌دهند. در صورتی که توالی‌هایی مزبور توسط عواملی مثل متیله‌شدن تغییر یافته باشند مورد شناسائی آنزیم قرار نمی‌گیرند. آنزیم های محدود کننده به طور متداول به ۴ گروه دسته بندی می شوند. این ۴ گروه از نظر ساختار، جایگاه شناسایی و چگونگی برش با یکدیگر متفاوتند. به منظور ایجاد برش در DNA، آنزیم های محدود کننده باید ستون قند-فسفات (sugar-phosphate backbone) را در هر دو رشته قطع کنند.
 
این آنزیم ها در [[باکتری]] ها و [[آرکی باکتری|آرکی ها]] یافت شده و یک مکانیسم دفاعی علیه [[ویروس]] های مهاجم ارائه می دهند <ref>Arber, W. and S. Linn, DNA modification and restriction. Annual review of biochemistry, 1969. 38(1): p. 467-500.</ref>,<ref>Krüger, D. and T.A. Bickle, Bacteriophage survival: multiple mechanisms for avoiding the deoxyribonucleic acid restriction systems of their hosts. Microbiological reviews, 1983. 47(3): p. 345.</ref>. در یک [[پروکاریوت]] ، آنزیم های محدود کننده به صورت انتخابی سبب برش DNAی خارجی در فرایندی که restriction نامیده شده است، می شوند. در حالیکه DNAی میزبان توسط آنزیم اصلاح کننده ( یک متیل ترنسفراز ) که سبب تصحیح DNAی پروکاریوت می شود، حفظ می شود. این دو فرایند سبب شکل گیری سیستم مدیفیکاسیون محدود کننده (restriction modification system ) می شوند<ref>Kobayashi, I., Behavior of restriction–modification systems as selfish mobile elements and their impact on genome evolution. Nucleic acids research, 2001. 29(18): p. 3742-3756.</ref>.
== آنزیم‌های محدودکننده نوع اول (I) ==
این دسته از آنزیم‌ها علاوه بر خاصیت برش دهندگی، دارای خاصیت متیله‌کنندگی نیز هستند. از جمله این آنزیم‌ها می‌توان به آنزیم‌های EcoK و EcoB که به ترتیب جایگاه‌های AACNNNNNNGTGC و TGANNNNNNNNTGCT را شناسایی می‌کنند. اگر یکی از دو رشته DNA در جایگاه مربوطه متیله باشد این آنزیم رشته مقابل را نیز متیله می‌کند اما اگر هیچ‌یک از دو رشته متیله نباشد این آنزیم DNA را در جایگاهی غیر اختصاصی که بیش از ۱۰۰۰ نوکلئوتید از جایگاه شناسایی فاصله دارد برش می‌دهد. این آنزیم‌ها به [[کوفاکتور]] ATP وS-Adnosyl Methionin و همچنین یون منیزیوم احتیاج دارند و ATP را [[آبکافت]] می‌کنند.
 
تاکنون بیش از ۳۰۰۰ آنزیم محدود کننده شناسایی شده اند که بیش از ۶۰۰ تا از آنها به صورت تجاری در دسترس می باشند <ref>Roberts, R.J., et al., REBASE—enzymes and genes for DNA restriction and modification. Nucleic acids research, 2007. 35(suppl 1): p. D269-D270.</ref>. این آنزیم ها به طور معمول برای اصلاح DNA در آزمایشگاه استفاده می شوند و یک ابزار حیاتی در شبیه سازی مولکولی می باشند <ref>Old, R.W. and S.B. Primrose, Principles of gene manipulation: an introduction to genetic engineering. Vol. 2. 1981: Univ of California Press.</ref> <ref>Bloom, M.V., G.A. Freyer, and D.A. Micklos, Laboratory DNA science: an introduction to recombinant DNA techniques and methods of genome analysis. 1996: Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc.</ref> <ref>Keuzer, H. and A. Massey, Recombinant DNA and Biotechnology, 2001, ASM press, Washington, DC ISBN.</ref>]
== آنزیم‌های محدودکننده نوع دوم (II) ==
این دسته از آنزیم‌های محدودکننده از متداول‌ترین نوع آنزیم‌های محدودکننده می‌باشند و کاربرد وسیعی در تاگ سازی([[کلونینگ]]) [[ژن]]‌ها، برش DNA به قطعات کوچک‌تر، نقشه‌برداری فیزیکی [[ژنوم]]، ایجاد مولکول‌های [[DNA نوترکیب]] دارند. این آنزیم‌ها توالی‌های ویژه‌ای را روی دو رشته DNA شناسایی کرده و آنرا برش می‌دهند. جایگاه شناسایی این آنزیم‌ها به صورت [[واروخوانه]] (پالیندروم) می‌باشند. در حالت واروخوانه دو رشته DNA مکمل و معکوس یکدیگر می‌باشند و دارای نقطه تقارن هستند. در این نوع مولکول DNA از دو طرفَ ۳ بهَ ۵ وَ ۵ بهَ ۳ یکسان خوانده می‌شود. به طوریکه هر رشته می‌تواند بر روی خود تا بخورد و [[ساختار سنجاق سر]] ایجاد کند. جایگاه شناسایی این دسته از آنزیم‌ها بین ۴ تا ۶ نوکلئوتید و گاهی تا ۸ نوکلئوتید می‌باشد.
=== تاریخچه ===
این پدیده برای اولین بار در کار آزمایشگاهی [[سالوادور لوریا]] و [[برتانی]] در اوایل سال ۱۹۵۰ کشف شد. آنها به این نتیجه رسیدند که [[باکتریوفاژ]] لامبدا که می تواند در یک سویه از [[اشریشیا کلی]] (به عنوان مثال گونه ای کلای C) رشد کند وقتی در گونه دیگری (به عنوان مثال ای کلای گونه K) رشد کند بازده محصول به طرز قابل توجهی کاهش می یابد. میزبان سلول (در این مثال ای کلای (K به عنوان میزبان محدود کننده شناخته شده و به نظر می رسد توانایی کاهش فعالیت بیولوژیکی فاژلامبدا را دارد <ref>UKWUBILE, C.A., Microbial Analysis of Greywater from Local Bathrooms and Its Health Implications in Bali Local Government Area Taraba State Nigeria. Journal: Journal of Advances in Biotechnology. 2(1)</ref>. در سال 1960 در آزمایشگاه های [[ورنر آربر]] و '''مسلسون''' نشان داده شد که محدودیت توسط برش آنزیمی فاژ DNA ایجاد شده. آنزیم درگیر در این فرایند آنزیم محدودکننده نامیده شد <ref>Meselson, M. and R. Yuan, DNA restriction enzyme from E. coli. Nature, 1968. 217(5134): p. 1110-1114.</ref> <ref>Dussoix, D. and W. Arber, Host specificity of DNA produced by Escherichia coli: II. Control over acceptance of DNA from infecting phage λ. Journal of molecular biology, 1962. 5(1): p. 37-49.</ref> <ref>Lederberg, S. and M. Meselson, Degradation of non-replicating bacteriophage DNA in non-accepting cells. Journal of molecular biology, 1964. 8(5): p. 623-628.</ref>.
 
آنزیم های محدود کننده مطالعه شده توسط آربر و مسلسون، آنزیم تیپ I بوده که به صورت تصادفی سبب برش DNA در جایگاه های شناسایی می شود <ref>Roberts, R.J., How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2005. 102(17): p. 5905-5908.</ref>. در سال ۱۹۷۰ '''همیلتون''' ، '''اسمیت'''، '''توماس''' و '''ویلکاکس''' اولین آنزیم محدود کننده تیپ ۲ (آنزیم Hind II) را از باکتری [[هموفیلوس آنفلوانزا]] کشف کردند <ref>Smith, H.O. and K. Welcox, A restriction enzyme from Hemophilus influenzae: I. Purification and general properties. Journal of molecular biology, 1970. 51(2): p. 379-391.</ref> <ref>Kelly, T.J. and H.O. Smith, A restriction enzyme from Hemophilus influenzae: II. Base sequence of the recognition site. Journal of molecular biology, 1970. 51(2): p. 393-409.</ref>. آنزیم های محدود کننده از این نوع در کار آزمایشگاهی بسیار مفید بوده و از آنها جهت برش DNA در جایگاه توالی شناسایی خاص استفاده می شود. بعدها [[دنیل ناتانس]] و کاتلین دانا نشان دادند که برش DNAی ویروس سیمین 40( SV40) توسط آنزیم های محدود کننده، قطعات با اندازه خاصی تولید کرده که می توان با استفاده از [[الکتروفورز]] ژل [[پلی اکریل آمید]] جداسازی کرد ، در نتیجه نشان داده شد که از آنزیم محدود کننده برای نقشه برداری DNA نیز می توان استفاده کرد<ref>Danna, K. and D. Nathans, Specific cleavage of simian virus 40 DNA by restriction endonuclease of Hemophilus influenzae. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1971. 68(12): p. 2913-2917.</ref>.
برخی آنزیم‌های محدودکننده بدست آمده از منابع متفاوت جایگاه‌های یکسانی را شناسایی می‌کنند و آن را به طور یکسان برش می‌دهند. به چنین آنزیم‌هایی اصطلاحاً ''ایزوشیزومر'' گفته می‌شود. مثلاً جایگاه شناسائی و محل برش آنزیم‌های محدودکننده HpaII و MspI بصورت C/CGG است.
 
به جهت کشف و شناسایی آنزیم ها در سال ۱۹۷۸ [[جایزه نوبل]] [[فیزیولوژی]] و [[پزشکی]] به ورنر آربر، [[دنیل ناتانس]] ، [[همیلتون]] و [[اسمیت]] اهدا شد <ref>Gigliotti, C., Leonardos Choice. 2009: Springer.</ref>. کشف آنزیم های محدود کننده منجر به دستکاری DNA و توسعه فناوری [[دی ان ای نوترکیب|DNAی نوترکیب]] شد که کاربردهای فراوانی دارد. به عنوان مثال سبب تولید [[پروتئین]] در مقیاس زیاد (مانند هورمون [[انسولین]] در بیماران دیابتی) شده است <ref>Villa-Komaroff, L., et al., A bacterial clone synthesizing proinsulin. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1978. 75(8): p. 3727-3731.</ref>.
برخی از آنزیم‌های محدودکننده جایگاه مشابهی را شناسایی می‌کنند ولی آن را به دو صورت مختلف برش می‌دهند، این آنزیم‌ها ''نئوشیزومر'' نامیده می‌شوند. آنزیم‌های محدودکننده SmaI و XmaI نئوشیزومر اند و جایگاه و محل برش آنها به ترتیب بصورت CCC/GGG و C/CCGGG می‌باشد.
 
برخی اندوکلئازهای محدودکننده که توالی هدف متفاوتی دارند، ممکن است انتهای چسبنده یکسانی ایجاد نمایند. برای مثال، آنزیم‌های BamHI با جایگاه شناسائی G/GATCC، BglII با جایگاه شناسائی A/GATCT و Sau۳A با جایگاه شناسائی /GATC، یک نوع انتهای چسبنده ایجاد می‌کنند. از اینرو انتهای ایجاد شده توسط آنزیم‌های فوق مکمل بوده و قبلیت شناسائی و اتصال به یکدیگر را دارند. این ویژگی از اهمیت بالایی در مطالعه و دست ورزی ژن‌ها برخوردار است.
===انواع ===
به طور طبیعی اندونوکلئاز های محدود کننده بر اساس ترکیب و [[کوفاکتور|کوفاکتورهای]] ضروری مورد نیاز آنزیم، ماهیت توالی هدف و ساختار جایگاه برش DNAی مناسب با جایگاه هدف، به چهار گروه (1،2،3،4) دسته بندی شده اند <ref>Bickle, T.A. and D. Krüger, Biology of DNA restriction. Microbiological reviews, 1993. 57(2): p. 434-450.</ref> <ref>Boyer, H.W., DNA restriction and modification mechanisms in bacteria. Annual Reviews in Microbiology, 1971. 25(1): p. 153-176.</ref> <ref> Yuan, R., Structure and mechanism of multifunctional restriction endonucleases. Annual review of biochemistry, 1981. 50(1): p. 285-315.</ref> . البته تجزیه و تحلیل توالی DNAی آنزیم های محدود کننده نشان داده اند که بیش از ۴ نوع آنزیم محدود کننده وجود دارد <ref>Perona, J.J., Type II restriction endonucleases. Methods, 2002. 28(3): p. 353-364.</ref>. همه انواع آنزیم ها توالی کوتاه و ویژه DNA را شناسایی کرده و قطعات خاص با انتهای ´۵ - فسفات ایجاد می کنند. در جایگاه برش، ساختار زیرواحد، جایگاه برش و کوفاکتورهای ضروری متفاوت می باشند <ref>Sistla, S. and D.N. Rao, S-Adenosyl-L-methionine–dependent restriction enzymes. Critical reviews in biochemistry and molecular biology, 2004. 39(1): p. 1-19.</ref>. انواع آنزیم های محدود کننده شامل:
==== آنزیم های تیپ ۱ ====
این آنزیم ها در جایگاه دور از مکان تشخیص، برش ایجاد می کنند . همچنین برای فعالیت به ATP و اس آدنوزیل ال- متیونین نیاز دارند. این آنزیم ها پروتئین های چند منظوره با هردو فعالیت محدود کنندگی و متیلازی می باشند
==== آنزیم های تیپ ۲ ====
در داخل محدوده و یا در فاصله کوتاهی از جایگاه شناسایی برش ایجاد می کنند. اکثرا برای فعالیت نیازمند منیزیم بوده و آنزیم های تک عملکردی مستقل از متیلاز می باشند.
==== آنزیم های تیپ ۳ ====
در فاصله کمی از جایگاه شناسایی، برش ایجاد می کنند. نیازمند ATP ( اما بدون تجزیه آن) هستند اما حضور اس آدنوزیل ال متیونین ضروری نمی باشد.
==== آنزیم های تیپ ۴ ====
این آنزیم ها DNA های تغییر یافته ( به عنوان مثال DNA های متیله شده، هیدروکسی متیله و گلیکوزیل هیدروکسی متیله ) را شناسایی کرده و برش می دهند.
 
آنزیم‌های محدودکننده به دو صورت برش ایجاد می‌کنند. در یک حالت، آنزیم قطعاتی ایجاد می‌کند که در دو انتها تک رشته‌ای و چسبنده می‌باشند. برای مثال، آنزیم EcoRI قطعاتی با انتهای چسبنده ایجاد می‌نماید. علت چسبنده نامیده شدن دو انتهای ایجاد شده، مکمل‌بودن آنها و قابلیت شناسائی و اتصال مجدد آنها به یکدیگر است. ناحیه چسبنده می‌تواند در انتهایَ ۵ یاَ ۳ ایجاد شود. در حالت دوم، آنزیم دو رشته DNA را بصورت عمودی برش داده و در نتیجه قطعاتی با انتهای صاف تولید می‌کند. برای مثال، آنزیم HpaI با برش DNA قطعاتی با انتهای صاف ایجاد می‌نماید.
=== چند نمونه از آنزیم‌های محدودکننده ===
 
== آنزیم‌های محدودکننده نوع III ==
این آنزیم‌ها از نظر عملکرد مشابه آنزیم‌های نوع I می‌باشند اما با آنکه به ATP به عنوان کوفاکتور نیاز دارند، آنرا [[هیدرولیز]](آبکافت) نمی‌کنند. EcoP۱۵(جایگاه (CAGCAG و EcoP۱ ازآنزیم‌های محدودکننده نوع III می‌باشند.
* آنزیم‌های محدودکننده نوع IV و نوع V هم وجود دارند.
 
== چند نمونه از آنزیم‌های محدودکننده ==
* SacI
* SalI
* HindIII
* BamI
* [[آنزیم ای کو آر ۱|EcoRI]]
* EcoRI
* KpnI
* XbaI
* XhoI
===کاربردها ===
از آنزیم های محدود کننده جهت انتقال ژن به وکتور [[پلاسمید|پلاسمیدی]] در فرایند کلونینگ ژن و تولید پروتئین استفاده می شود.
 
جهت استفاده بهینه، در پلاسمید هایی که به صورت متداول برای کلونینگ ژن استفاده می شوند، یک توالی کوتاه پلی لینکر(a short polylinker sequence) قرار می گیرد که به آن multiple cloning site یا به اختصار '''MCS''' گفته می شود. این توالی دارای جایگاه شناسایی آنزیم محدود کننده است و آنزیم محدود کننده قادر است این توالی را شناسایی کند.
 
جایگاه های محدود کننده تعیین می کند که ما از چه نوع اندونوکلئازی جهت هضم DNA باید استفاده کنیم. هنگام کلون کردن یک قطعه ژن به داخل وکتور هردو DNAی پلاسمید و ژن وارد شده با آنزیم های محدود کننده یکسانی برش داده می شوند، و سپس با کمک آنزیم DNA لیگاز به یکدیگر متصل می شوند <ref>Sambrook, J., E. Fritsch, and T. Maniatis, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Laboratory. Cold Spring Harbor, NY. VIII. Appendix A. pBIND Vector Sequence (continued) A. pBIND Vector Sequence (continued) B. pBIND Vector Restriction Sites Enzyme# of Sites Location Dra I, 1989. 4(1857): p. 4877.</ref>.
 
آنزیم های محدود کننده نیز می توانند به طور ویژه برای تشخیص آلل های ژن با تغییرات تک باز شناخته شده در DNA که به عنوان پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی شناخته می شوند، استفاده شوند<ref>Zhang, R., et al., SNP Cutter: a comprehensive tool for SNP PCR–RFLP assay design. Nucleic acids research, 2005. 33(suppl 2): p. W489-W492.</ref>. در این روش آنزیم محدود کننده می تواند برای [[ژنوتیپ]] یک DNA بدون نیاز به هزینه های سنگین توالی یابی ژن استفاده شود. ابتدا نمونه با آنزیم های محدود کننده هضم شده تا سبب تولید قطعات DNA شود و سپس قطعات با اندازه های مختلف توسط ژل الکتروفورز از هم جدا می شوند. به طور کلی آلل ها با جایگاه های شناسایی صحیح، دو باند DNA بر روی ژل تولید می کنند و با جایگاه های محدود کننده تغییر یافته برش نخواهند خورد. در صورت عدم برش، تنها یک باند بر روی ژل ایجاد می شود<ref>Vandergeest, P., Mapping nature: Territorialization of forest rights in Thailand. 1996.</ref>.
 
توسط هضم آنزیمی، طول های متفاوتی از DNA ایجاد می گردد که سبب ظهور الگوی ویژه ای از باند ها بعد از الکتروفورز می شود. از این الگو می تواند برای انگشت نگاری DNA استفاده گردد. در روشی مشابه ، آنزیم های محدود کننده برای هضم DNAی ژنومی جهت تجزیه و تحلیل DNA توسط ساترن بلات استفاده شده است . این روش سبب می شود محققان بتوانند به شناسایی چگونگی تکثیر بالا از یک ژن موجود در ژنوم فرد یا چگونگی جهش های ژنی موجود در جمعیت بپردازند.
 
 
== جستارهای وابسته ==
 
== منابع ==
{{چپ چین}}
{{پانویس}}
<div dir="ltr">
۱۵۲

ویرایش